UV/VIS-Detektion in der HPLC – Das Arbeitstier der modernen Flüssigkeitschromatographie
Wenn die meisten Anwender an HPLC-Detektoren denken, fällt ihnen als Erstes der UV/VIS-Absorptionsdetektor ein. Egal ob in der Pharma-, Lebensmittel- oder Umweltanalytik, die UV-Detektion ist so weit verbreitet, dass sie oft der erste Ansatzpunkt für neue HPLC-Anwendungen ist.
Es ist kein Zufall, dass sie so beliebt ist: UV-Detektoren sind empfindlich, robust, stabil, erschwinglich und mit fast allen HPLC-Workflows kompatibel, einschließlich der Gradientenelution. Ganz gleich, ob du gerade erst in die HPLC einsteigst oder schon ein Profi bist, der komplexe Methoden verfeinert – es ist entscheidend, die Funktionsweise der UV/VIS-Detektion zu verstehen, um effiziente Analysen und zuverlässige Dateninterpretation zu gewährleisten.
Lass uns tiefer in diese wesentliche Detektionstechnik für die HPLC-Analyse eintauchen!
💡So funktioniert die UV/VIS-Detektion
UV/VIS-Detektoren in der HPLC sind Inline-Geräte, die die Absorption von ultraviolettem oder sichtbarem Licht bei einer oder mehreren Wellenlängen messen, während die Analyten durch eine Durchflusszelle fließen (Abbildung 1). Dieser Vorgang basiert auf dem Lambert-Beerschen Gesetz, das die Absorption mit der Konzentration einer Substanz in Beziehung setzt: Die Absorption ist direkt proportional zur Konzentration des Analyten in der Messzelle.

Abbildung 1: Prinzip der UV-Detektion mit Absorption nach dem Lambert-Beerschen Gesetz. (Grafik von KNAUER)
Wenn die Verbindungen aus der Säule eluieren, verringern diejenigen, die Licht bei der gewählten Wellenlänge absorbieren, die Lichtintensität, die den Detektor erreicht. Diese Verringerung wird im Chromatogramm als Peak dargestellt. Anhand dieses Signals lässt sich die Menge einer aus der HPLC-Säule austretenden Verbindung quantifizieren.
💡Welche Verbindungen absorbieren UV- oder sichtbares Licht?
Absorption entsteht im Allgemeinen durch elektronische Übergänge in Molekülorbitalen bei Strukturen wie:
- Aromatischen Ringen
- Konjugierten Doppelbindungen
- Heterozyklen
- Peptid- und Proteinchromophoren
Tabelle 1 zeigt die typischen UV-Absorptionsmaxima verschiedener organischer chromophorer Gruppen. UV/VIS-Detektoren können über einen breiten Wellenlängenbereich (z. B. 190 - 700 nm) hinweg arbeiten und ermöglichen dadurch die Detektion vieler unterschiedlicher Verbindungstypen.
Deshalb ist die UV-Detektion ein so leistungsstarkes Werkzeug für gängige niedermolekulare pharmazeutische Wirkstoffe und biologische Analyten.
Tabelle 1: Überblick über die UV-Absorptionseigenschaften organischer funktioneller Gruppen mit chromophoren (lichtabsorbierenden) Eigenschaften. (Grafik von KNAUER)
💡Typen von UV/VIS-Detektoren
In der HPLC gibt es drei Haupttypen von UV/VIS-Detektoren: Detektoren mit fester Wellenlänge, Detektoren mit variabler Wellenlänge (VWD) oder Mehrwellenlängen-Detektoren (MWD) sowie Diodenarray- oder Photodiodenarray-Detektoren (DAD/PDA). Modelle mit fester Wellenlänge verwenden Licht einer einzigen, bestimmten Wellenlänge, das direkt von der Lampe ausgestrahlt wird. Detektoren mit variabler Wellenlänge und Diodenarray-Detektoren hingegen nutzen eine Breitband-Lichtquelle, sodass eine oder mehrere Wellenlängen zur Überwachung ausgewählt werden können.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der optischen Aufbauten in UV/VIS-Detektoren. Links: Bei einem Standard-UV/VIS-Detektor wählt ein Monochromator eine einzelne Wellenlänge aus, die durch die Flusszelle gelangt. Das durchgelassene Licht wird von einer Photodiode gemessen, um ein Signal zu erzeugen. Rechts: Bei einem Diodenarray-Detektor durchläuft das gesamte Lichtspektrum die Flusszelle, und das durchgelassene Licht wird durch ein feststehendes Gitter auf eine Anordnung von Photodioden gestreut. (Grafik von KNAUER)
1. Festwellenlängen-Detektoren
Festwellenlängen-Detektoren messen die Absorption nur bei einer bestimmten Wellenlänge. Diese Art von UV-Detektoren ist einfach, robust und kostengünstig und bietet eine hohe Empfindlichkeit bei einer spezifischen Wellenlänge. Aufgrund ihres unkomplizierten Aufbaus findet man diese Bauweise vor allem in Lehr-, Kompakt- oder tragbaren Systemen.
Früher wurden dafür Niederdruck-Quecksilberlampen als Lichtquelle verwendet, da diese eine sehr intensive, monochromatische Emissionslinie bei 254 nm aufweisen. Durch Hinzufügen von Phosphor zur Lichtquelle oder durch den Einsatz einer Zinkdampflampe bzw. optischer Filter konnten auch andere Wellenlängen wie 280 nm, 265 nm oder 214 nm zur Detektion genutzt werden. In modernen Geräten wurden Quecksilberlampen weitgehend durch LEDs ersetzt, um eine verbesserte Stabilität und Langlebigkeit zu erreichen. Die gängigsten Wellenlängen sind hier 254 nm oder 260 nm sowie 280 nm.
Bei diesen Detektoren durchläuft das Licht die Durchflusszelle, die die mobile Phase und den Analyten enthält. Das durchgelassene Licht wird von einer Photodiode gemessen und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Die meisten Systeme verwenden eine Referenzzelle, um das Probensignal mit der Referenz (oft Luft) zu vergleichen, und die Differenz wird gemäß dem Lambert-Beerschen-Gesetz in Absorption umgerechnet.
Obwohl sie weniger flexibel sind als Detektoren mit variabler Wellenlänge oder Diodenarrays, bleiben Modelle mit fester Wellenlänge eine zuverlässige und wirtschaftliche Option für Routineanwendungen, bei denen eine konstante Empfindlichkeit bei einer einzigen Wellenlänge entscheidend ist.
2. Variable Einzelwellenlängen-Detektoren (UVD, VWD) (UVD, VWD)

Abbildung 3: Variable Einzelwellenlängen-UV/VIS-Detektoren von KNAUER. Von links nach rechts: AZURA® UVD 2.1S, AZURA® UVD 2.1L, BlueShadow 40D. (Grafik von KNAUER)
Variable Einzelwellenlängen-Detektoren messen ebenfalls die Absorption bei einer einzigen Wellenlänge, doch im Gegensatz zu Detektoren mit fester Wellenlänge kann diese Wellenlänge flexibel über einen weiten Bereich (typischerweise 190 - 700 nm) ausgewählt werden. Diese Flexibilität macht sie zum Standarddetektor für die meisten routinemäßigen HPLC-Anwendungen.
Eine Breitbandlichtquelle, in der Regel eine Deuteriumlampe, erzeugt kontinuierliche UV/VIS-Strahlung. Das polychromatische Lichtspektrum wird in einen Monochromator geleitet, der aus einem Eingangsspalt, einem beweglichen Beugungsgitter und einem Ausgangsspalt besteht. Das motorisierte Gitter zerlegt das Lichtspektrum, und je nach seiner Position kann eine bestimmte Wellenlänge durch den Ausgangsspalt ausgewählt werden, die dann durch die Durchflusszelle gelangt. Das durchgelassene Licht wird von einer Photodiode gemessen, die die Lichtenergie in elektrische Signale umwandelt (Abbildung 2, links). Bei den meisten heute auf dem Markt erhältlichen Geräten ist ein Doppelstrahl-Design üblich. Hier teilt ein Strahlteiler oder ein halbdurchlässiger Spiegel den Lichtstrahl, nachdem dieser den Austrittsspalt passiert hat, in einen Proben- und einen Referenzstrahl auf. Die Intensität jedes Strahls wird von einer separaten Photodiode erfasst und gemäß dem Lambert-Beerschen-Gesetz in ein quantitatives Signal umgewandelt. Nur der Probenstrahl durchläuft die Durchflusszelle.
Da die Wellenlänge für jeden Analyten optimiert und sogar so programmiert werden kann, dass sie sich während eines Laufs ändert, beispielsweise zur Überwachung eines Peaks bei 220 nm und eines weiteren bei 280 nm, bieten UVDs oder VWDs eine hervorragende Empfindlichkeit und Selektivität. Diese Detektoren bieten ein ausgezeichnetes Gleichgewicht zwischen Leistung, Flexibilität und Einfachheit und eignen sich daher ideal für Verbindungen, die bei bestimmten Wellenlängen absorbieren oder lichtempfindlich sind, da die Probe während der Detektion nicht dem gesamten Lichtspektrum ausgesetzt ist.
3. Mehrwellenlängen-Detektoren (MWD)

Abbildung 4: Die Mehrwellenlängen-UV/VIS-Detektoren von KNAUER. Von links nach rechts: AZURA® MWD 2.1L, AZURA® VWD 2.1L, BlueShadow 50D. (Grafik von KNAUER)
Mehrwellenlängen-Detektoren können die Absorption bei mehreren Wellenlängen gleichzeitig messen, typischerweise im Bereich von 190 bis 600 nm, in einigen Fällen bis zu 1000 nm. Am häufigsten sind Modelle, die bis zu vier Wellenlängen gleichzeitig messen. Somit erfassen diese Detektoren mehr Informationen in einem einzigen Lauf.
MWDs basieren in der Regel auf dem Design von variablen Einzelwellenlängen-Detektoren und verwenden ebenfalls eine Deuteriumlampe für die UV/VIS-Detektion. Zur Erweiterung des sichtbaren Bereichs kann eine Wolframlampe hinzugefügt werden, was eine breite spektrale Abdeckung ermöglicht. Einige Hersteller bieten eine abgespeckte Version eines Diodenarray-Detektors als MWD zu einem günstigeren Preis an, jedoch ohne Spektralscan-Fähigkeit und 3D-Funktionalität.
Als eine Art Hybrid zwischen UVDs/VWDs und DADs sind MWDs preislich attraktive Geräte für den Betrieb am UV-Absorptionsmaximum mit Wellenlängenumschaltoption, ideal geeignet für Analyten mit mehreren Chromophoren, wie viele pharmazeutische Verbindungen.
4. Diodenarray-/Photodiodenarray-Detektoren (DAD/PDA)

Abbildung 5: Diodenarray-UV/VIS-Detektoren von KNAUER. Von links nach rechts: AZURA® DAD 2.1L, AZURA® DAD 6.1L. (Grafik von KNAUER)
Diodenarray-Detektoren (DAD), auch als Photodiodenarray-Detektoren (PDA) bekannt, messen gleichzeitig das gesamte UV/VIS-Spektrum eines Analyten, typischerweise von 190 bis 1000 nm. Im Gegensatz zu Ein- oder Mehrwellenlängen-Detektoren, die nur ausgewählte Wellenlängen erfassen, erfassen sie die Absorption über das gesamte Spektrum für jeden Peak. So liefern sie sowohl quantitative als auch spektrale Informationen in einem einzigen Lauf.
In einem DAD/PDA läuft das gesamte Licht einer Deuterium- und Wolframlampe direkt durch die Durchflusszelle, anschließend wird das durchgelassene Licht durch ein Beugungsgitter auf eine Anordnung von Photodioden gestreut, die üblicherweise aus 256, 512 oder 1024 Dioden besteht. Jede Diode misst gleichzeitig die Lichtintensität bei einer bestimmten Wellenlänge und erzeugt so einen dreidimensionalen Datensatz (Absorption vs. Zeit vs. Wellenlänge) (Abbildung 2, rechts).
Diese Technologie ermöglicht die
- Identifizierung von Verbindungen durch Abgleich von UV/VIS-Spektren und Bibliotheksabfragen.
- Überprüfung der Peakreinheit durch Vergleich der Übereinstimmung der Absorptionsprofile an verschiedenen Punkten entlang des Peaks, um koeluierende Verunreinigungen/Verbindungen mit unterschiedlichen UV/VIS-Spektraleigenschaften zu erkennen.
- Nachträgliche Wellenlängenauswahl, ohne die Probe erneut zu analysieren. Wenn eine Messung im Vollspektrummodus durchgeführt wurde, können die Chromatogramme später bei anderen Detektionswellenlängen neu aufbereitet werden.
- Umfassende Methodenentwicklung, insbesondere für komplexe oder unbekannte Proben.
Natürlich kann ein DAD auch so betrieben werden, dass Daten nur bei einer oder mehreren Wellenlängen erfasst werden, ohne das gesamte Spektrum aufzuzeichnen.
Da sie die Quantifizierung bei mehreren Wellenlängen mit einem vollständigen Spektralscan kombinieren können, haben sich DAD/PDA-Detektoren zum Standard in modernen pharmazeutischen, analytischen und Forschungslabors entwickelt. Sie bieten ein hervorragendes Gleichgewicht zwischen Empfindlichkeit, Flexibilität und Datensatzumfang und eignen sich ideal für die Methodenentwicklung sowie die Analyse komplexer Gemische oder Proben unbekannter Zusammensetzung.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die höhere Flexibilität eines DAD hinsichtlich der Wellenlängenauswahl sowie die Möglichkeit, detailliertere Informationen aus den Proben zu gewinnen, der Grund dafür sind, dass er für die meisten Labore die erste Wahl ist. Für Routineanalysen ist die zusätzliche Empfindlichkeit des einfachen variablen Einzelwellenlängen-Detektors attraktiver.
💡Wichtige Leistungsmerkmale von UV/VIS-Detektoren
UV-Detektoren sind aufgrund ihrer ausgewogenen Kombination aus Empfindlichkeit, Stabilität und Kosten sehr beliebt. Zu ihren standardmäßigen Leistungsspezifikationen gehören:
Empfindlichkeit
Die typischen Nachweisgrenzen liegen im ng- bis µg-Bereich, abhängig vom Analyten und der Systemauslegung.
Linearität
Eine der Stärken der UV-Detektion ist ihr ausgezeichneter linearer Dynamikbereich, der oft mehr als 4 - 5 Größenordnungen umfasst und eine einfache und zuverlässige Quantifizierung gewährleistet.
Rauschen und Drift
Die geringen Rauschwerte und die Basislinienstabilität von UV-Detektoren verbessern die Quantifizierung, insbesondere bei Gradientenmethoden.
Flusszellen-Design
Die verwendeten Durchflusszellen bestehen in der Regel aus Edelstahl oder Quarzglas, haben eine Weglänge von 50 mm oder weniger und ein Zellvolumen von 2 - 10 μL. Sie sind mit geringem Totvolumen ausgelegt, um die Peakverbreiterung zu minimieren. Darüber hinaus sind spezielle Mikro-, semi-präparative oder präparative Flusszellen für nahezu jede spezifische Anwendung erhältlich, auch in biokompatiblen Ausführungen. Entdecken Sie hier das gesamte Flusszellen-Sortiment von KNAUER.
💡Vorteile & Grenzen der UV/VIS-Detektion in der HPLC
UV/VIS-Detektoren gehören zu den am häufigsten verwendeten Detektoren in der HPLC, da sie einfach, zuverlässig und für viele Analyten äußerst effektiv sind. Die meisten niedermolekularen pharmazeutischen Wirkstoffe und viele Naturstoffe absorbieren UV-Licht, was diese Technik zur ersten Wahl in Analyse- und Qualitätskontrolllaboren für Routineanalysen, vorgeschriebene pharmazeutische Prüfungen und Methodenvalidierungen macht.
Wichtige Vorteile
- Einfache und kostengünstige Technik
- Hohe Zuverlässigkeit und einfache Bedienung bei minimalem Wartungsaufwand
- Hervorragende quantitative Genauigkeit und Präzision (< 0,2 % RSD) mit einem großen linearen Bereich (> 10⁵)
- Hohe Empfindlichkeit für UV-aktive Substanzen (hohe molare Absorptionskonstante ε)
- Kompatibel mit Gradientenelution und gängigen HPLC-Lösungsmitteln
- Relativ unempfindlich gegenüber Änderungen der mobilen Phase (Flussraten und Brechungsindex) oder Temperaturschwankungen
- Nicht-destruktive Detektion, die bei Bedarf weitere Analysen ermöglicht
- Automatisierungsfreundlich, mit integrierter Diagnose und Wellenlängenkalibrierung in vielen Systemen
Einschränkungen
Trotz ihrer Stärken weist die UV/VIS-Detektion einige Einschränkungen auf:
- Erfordert einen Chromophor – Verbindungen ohne UV-absorbierende Gruppen können nicht effektiv nachgewiesen werden
- Geringere Selektivität im Vergleich zu Techniken wie Fluoreszenz oder Massenspektrometrie, da ähnliche Verbindungen mit gleichen Chromophor-Gruppen sehr ähnliche UV/VIS-Spektren aufweisen können
- Die Response variiert je nach Verbindung in Abhängigkeit von deren molarem Absorptionskoeffizienten ε
- UV-Cutoff-Werte des Lösungsmittels können die Auswahl der mobilen Phase und das Methodendesign einschränken, insbesondere bei niedrigen Wellenlängen
- Möglicherweise eingeschränkte Empfindlichkeit bei sehr hohen oder sehr niedrigen Wellenlängen
In der Praxis sind diese Einschränkungen für die meisten Anwendungen handhabbar. Für nicht UV-aktive Substanzen können jedoch universellere Detektoren wie der Brechungsindexdetektor (RID), der Verdampfungs-Lichtstreudetektor (ELSD) oder der Charged Aerosol Detektor (CAD) besser geeignet sein.
Exkurs: Überlegungen zur mobilen Phase und UV-Cutoffs
Lösungsmittel und Additive können selbst UV-Licht absorbieren. Bei der Verwendung der UV/VIS-Detektion in der HPLC muss die mobile Phase daher bei der gewählten Detektionswellenlänge UV-transparent sein, um eine zuverlässige Detektion zu gewährleisten.
Die UV-Cutoff eines Lösungsmittels ist die Wellenlänge, bei der seine Absorption einen Wert von 1 AU erreicht. Arbeiten bei oder unterhalb dieser Wellenlänge kann zu einer hohen Hintergrundabsorption, erhöhtem Rauschen und instabilen Basislinien führen, was die Empfindlichkeit verringert. Die gewählte Wellenlänge sollte daher über dem UV-Cutoff des Lösungsmittels liegen. Tabelle 2 fasst die UV-Cutoffs gängiger Lösungsmittel und Additive zusammen, die in der HPLC verwendet werden.
Zu beachten ist ebenfalls, dass Pufferkomponenten und saure Modifikatoren auch unterhalb von 220 - 230 nm stark absorbieren können, was die Verwendung sehr niedriger Detektionswellenlängen weiter einschränken kann. Die Auswahl UV-transparenter Lösungsmittel und Additive ist daher ein wichtiger Bestandteil der HPLC-Methodenentwicklung, um hohes Rauschen und Basislinien-Drifts zu vermeiden.
Tabelle 2: UV-Cutoff-Werte gängiger, in der HPLC verwendeter Lösungsmittel und Additive.
💡Wann UV/VIS-Detektion gut funktioniert – und wann nicht
Die UV/VIS-Detektion eignet sich am besten für Verbindungen, die im UV-Bereich (ca. 190 - 400 nm) stark absorbieren und in Lösung stabil sind. Sie ist besonders effektiv für Analyten, die in mittleren Konzentrationen vorliegen und Chromophore wie aromatische Ringe oder konjugierte Doppelbindungen enthalten.
Zu den gängigen UV-aktiven Verbindungen gehören:
- Arzneimittel und Wirkstoffe
- Aromatische Verbindungen
- Aminosäuren, Peptide und Proteine (werden in der Regel bei 214, 220 oder 280 nm nachgewiesen)
- Pestizide
- Lebensmittelzusatzstoffe und Farbstoffe
- Naturstoffe wie Flavonoide und Phenole
Viele Verbindungen zeigen aufgrund von σ → σ*-Übergängen auch eine gewisse Absorption unterhalb von 220 nm, wobei die Absorption des Lösungsmittels bei der Detektion bei diesen niedrigen Wellenlängen eine größere Rolle spielt.
Wann UV-Detektion nicht ideal ist
Die UV-Detektion eignet sich weniger für Verbindungen ohne Chromophore, z.B.:
- Zucker
- Triglyceride und viele Lipide
- Kleine organische Säuren
- Einige Polymere oder anorganische Ionen
Diese Analyten absorbieren wenig oder gar kein UV-Licht, was zu einer geringen Empfindlichkeit führt. Die UV-Detektion kann auch bei sehr niedrigen Analytkonzentrationen, komplexen Matrices oder koeluierenden Verbindungen mit ähnlichen UV-Spektren Schwierigkeiten bereiten. In solchen Fällen sind alternative Detektoren wie ELSD, CAD, RID, FLD oder Massenspektrometrie (MS) möglicherweise besser geeignet. Mehr dazu gibt es in den kommenden Beiträgen unserer Blogreihe „Sehen heißt Verstehen – Detektion leicht gemacht“.
Typische Anwendungsbereiche

Abbildung 6: Anwendungsbereiche der UV-Detektion in der HPLC. (Grafik von KNAUER. Symbole erstellt mit DALL-E 3, OpenAI, GPT-5.4; 10. März 2026)
Aufgrund der oben beschriebenen Eigenschaften wird die UV/VIS-Detektion in vielen Bereichen eingesetzt, beispielsweise in der pharmazeutischen Analytik zur Sicherung der Produktqualität durch Assays, Verunreinigungsuntersuchungen, Dosierungsgleichmäßigkeits- und Stabilitätsstudien, in der Umweltüberwachung zum Nachweis aromatischer Schadstoffe und Pestizide in Wasser oder Boden sowie in der Lebensmittel- und Getränkeanalyse, z. B. zur Quantifizierung von Farbstoffen und Phenolverbindungen in Produkten wie Wein oder Tee.
Bei KNAUER nutzen wir UV/VIS-Detektoren für eine Vielzahl praktischer Anwendungen und erschließen ihr volles Potenzial in verschiedensten Bereichen. So ermöglicht die UV/VIS-Detektion beispielsweise die Charakterisierung wichtiger organischer Verbindungen in Wein und Traubensaft zum Qualitätsvergleich, unterstützt in Kombination mit MS die Qualitätskontrolle von Oligonukleotiden zur Identifizierung von Verunreinigungen und zur Massenbestätigung und ermöglicht die Charakterisierung von Cannabinoiden in CBD-Aromaölen, um die Einhaltung gesetzlicher Vorschriften wie THC-Grenzwerte zu überprüfen. Sie wird auch in fortschrittlichen Verfahren zur Aufreinigung von Cannabinoiden wie der CBG-Isolierung eingesetzt, sowie bei der Methodenoptimierung, z. B. zur Verbesserung der Basislinienstabilität bei TFA-haltigen mobilen Phasen.
Entdecke hier alle unsere Fallstudien und Anwendungsbeispiele.
💡Fazit
Die UV/VIS-Detektion ist das Rückgrat der modernen HPLC, da sie den optimalen Kompromiss zwischen Empfindlichkeit, Einfachheit, Robustheit und Kosteneffizienz bietet.
Zwar ist sie nicht universell einsetzbar, eignet sich jedoch hervorragend für die meisten UV-aktiven Analyten, wie sie in Pharma-, Umwelt-, Lebensmittel- und Forschungslaboren vorkommen. Darüber hinaus kann mit der DAD/PDA-Technologie die analytische Leistungsfähigkeit ohne viel höherem Komplexitätsaufwand erheblich gesteigert werden.
Entscheiden Sie sich noch heute für die UV/VIS-Detektion und entdecken Sie die große Auswahl an UV/VIS-Detektoren von KNAUER oder wenden Sie sich an unser Vertriebsteam, um Unterstützung bei der Auswahl des passenden Detektors für Ihre Anwendung zu erhalten.
Im nächsten Beitrag dieser Blog-Reihe werfen wir einen Blick auf die Brechungsindexdetektion (RID), eine universelle Alternative, wenn Analyten keine Chromophore aufweisen und die UV-Detektion keine Option mehr ist.
Für weitere Informationen zu diesem Thema wenden Sie sich bitte an unsere Autorin: huhmann@knauer.net
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