Überblick über HPLC-Detektionstechniken – Das große Ganze
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zählt zu den am häufigsten eingesetzten Methoden in der analytischen Chemie. Sie spielt eine zentrale Rolle in Bereichen wie Pharmazie, Bioprozessentwicklung, Umweltanalytik und Polymercharakterisierung. So wichtig die chromatographische Trennung auch ist, sie erzählt nur die halbe Geschichte. Erst ein geeigneter HPLC-Detektor macht aus der Trennung verwertbare Daten, indem er den eluierenden Analyten in ein messbares Signal umwandelt.
Zum Auftakt unserer HPLC-Detektor-Blogserie stellen wir die wichtigsten Detektionsprinzipien vor und zeigen Ihnen, wie Sie den perfekten Detektor für Ihre Anwendung auswählen.
Warum die Detektion in der HPLC so wichtig ist
Vereinfacht gesagt ist der Detektor das „Auge“ des HPLC-Systems. Er überwacht das Eluat, während die einzelnen Substanzen die Säule verlassen, und übersetzt ihre Anwesenheit in elektronische Signale, die im Chromatogramm als Peaks sichtbar werden.
Bei der Auswahl eines HPLC-Detektors spielen mehrere Faktoren eine entscheidende Rolle:
- Empfindlichkeit: Welche minimale Konzentration zuverlässig quantifiziert werden kann. Je höher die Empfindlichkeit, desto kleinere Substanzmengen lassen sich sicher bestimmen
- Selektivität: Ob nur bestimmte Analyten oder möglichst alle Komponenten detektiert werden.
- Linearität und Dynamischer Bereich: Wie genau Messergebnisse bei niedrigen und hohen Konzentrationen bleiben.
- Kompatibilität: Wie gut der Detektor mit Lösungsmitteln, Gradienten, Temperaturen und anderen chromatographischen Bedingungen harmoniert.
In der Praxis gibt es keinen universellen „besten“ Detektor. Die optimale Wahl hängt von mehreren Faktoren ab: der chemischen Natur des Analyten, den Anforderungen der Anwendung und nicht zuletzt vom verfügbaren Budget.
Abbildung 1: Typische HPLC-Systemkonfiguration mit zwei Detektoren. (Grafik von KNAUER)
Wichtige Detektionsprinzipien in der HPLC
Es existieren zahlreiche unterschiedliche HPLC-Detektoren, die sich jedoch meist fünf Hauptkategorien zuordnen lassen:
- Optische Detektoren
- Massenbasierte Detektoren
- Elektrochemische Detektoren
- Bulk-Property-Detektoren
- Spezialisierte bzw. anwendungsspezifische Detektoren
Die zugrunde liegenden Detektionstechniken lassen sich in drei übergeordnete Gruppen einteilen:
- Substanzspezifische Detektion
- Detektion von Stoffeigenschaften
- Kopplungstechniken (engl. Hyphenated techniques)
Substanzspezifische Detektoren reagieren auf bestimmte Eigenschaften eines Analyten, die nicht bei allen Verbindungen vorkommen. Bulk-Property-Detektoren messen dagegen eine physikalische Eigenschaft, die allen Substanzen gemeinsam ist. Sie erfassen Veränderungen dieser Eigenschaft, indem sie die mobile Phase mit Probe mit der reinen mobilen Phase vergleichen. Dadurch gelten sie als universelle Detektoren. „Hyphenated techniques“ bezeichnen die Kopplung eines HPLC-Systems mit einem weiteren analytischen Instrument, um erweiterte Detektionsmöglichkeiten zu erhalten.
Im Verlauf dieser Blogserie widmen wir uns in jedem Beitrag einem bestimmten Detektortyp, inklusive Funktionsweise, typischer Einsatzgebiete und möglicher Einschränkungen.
Tabelle 1: Gängige HPLC-Detektoren (Grafik von KNAUER)
1. Optische Detektoren
Optische Detektoren messen die Wechselwirkung von Licht mit dem Analyten. Sie gehören zu den am häufigsten eingesetzten Detektoren in der routinemäßigen HPLC-Analytik und umfassen unter anderem:
- UV/VIS-Absorptionsdetektoren (UVD/DAD/PDA)
- Fluoreszenzdetektoren (FLD)
- Detektoren für optische Rotation oder Zirkulardichroismus (z. B. für chirale Anwendungen)
- Lichtstreudetektoren (ELSD, CAD, MALS)
Optische Detektionsmethoden sind besonders beliebt, da sie empfindlich, gut etabliert und oft sehr selektiv sind, z.B.:
- UV-Detektoren erfassen Verbindungen mit Chromophoren.
- Fluoreszenzdetektoren eignen sich für natürlich fluoreszierende oder derivatisierte Analyten.
- ELSD und CAD ermöglichen die Detektion von Substanzen ohne UV-Absorption, indem sie nicht-flüchtige Analytpartikel messen, die nach der Verdampfung der flüchtigen mobilen Phase entstehen.
Diese Detektoren kommen häufig in der pharmazeutischen Analytik, Umweltanalytik, Polymeranalytik und Lebensmittelchemie zum Einsatz.
2. Massenspektrometrische Detektoren
Die Massenspektrometrie (MS) gilt in vielen Bereichen als Goldstandard der Detektion und das aus gutem Grund. Sie bietet:
- Sehr hohe Empfindlichkeit
- Extrem hohe Selektivität
- Strukturinformationen (Molekülmasse und Fragmentierungsmuster)
Streng genommen ist MS keine universelle Detektion, da nur ionisierbare Substanzen erfasst werden können. Dennoch machen ihre Vielseitigkeit, ihre Leistungsfähigkeit bei Spurenanalysen sowie die Eignung für qualitative und quantitative Analysen sie in der modernen HPLC unverzichtbar.
3. Elektrochemische Detektoren
Einige Verbindungen können an Elektroden oxidiert oder reduziert werden. Elektrochemische Detektoren nutzen diese Reaktionen und ermöglichen eine extrem empfindliche Detektion – bis in den Pico- oder sogar Femtogrammbereich, sofern der Analyt geeignet ist. Sie werden häufig für Neurotransmitter, Katecholamine, Vitamine und andere redoxaktive pharmazeutische Wirkstoffe eingesetzt. Aufgrund ihrer hohen Selektivität erfordern sie jedoch besonders saubere mobile Phasen und eine sorgfältige Optimierung der Messbedingungen.
4. Bulk-Property Detektoren
Diese Detektoren messen keine spezifischen Eigenschaften einzelner Analyten, sondern registrieren Veränderungen physikalischer Eigenschaften der mobilen Phase beim Eluieren einer Substanz. Typische Beispiele sind:
- Brechungsindexdetektoren (engl. Refractive Index Detector (RID))
- Viskositätsdetektoren
- pH-Detektoren
Bulk-Property-Detektoren sind oft universell einsetzbar und besonders hilfreich für Analyten ohne Chromophore. Allerdings sind sie meist weniger empfindlich und häufig nur eingeschränkt mit Gradientenelutionen kompatibel.
5. Spezialisierte HPLC-Detektoren
Für bestimmte Anwendungen kommen hochselektive Spezialdetektoren zum Einsatz, zum Beispiel:
- Radioaktivitätsdetektoren (z. B. für Tracerstudien oder die Nuklearmedizin)
- MALS (Multi-Angle Light Scattering) zur Bestimmung absoluter Molekulargewichte
- Chirale Detektoren zur Bestimmung der Enantiomerenreinheit
Auch wenn diese Systeme stark anwendungsspezifisch sind, liefern sie oft einzigartige und besonders aussagekräftige Informationen.
Abbildung 2: In der HPLC verwendete Detektortypen. (Grafik von KNAUER)
Fazit: Der richtige Detektor macht den Unterschied
Selbst die beste chromatographische Trennung bleibt ohne Aussagekraft, wenn wir sie nicht sehen können. Deshalb ist die Detektion einer der wichtigsten Aspekte in der HPLC. Ein Verständnis der Detektionsprinzipien hilft dabei, den richtigen Detektortyp für die jeweilige Anwendung auszuwählen und Ihre Ergebnisse wirklich sichtbar zu machen.
Im nächsten Blogbeitrag gehen wir der Frage nach, warum es so viele unterschiedliche Detektoren gibt und welche Leistungsmerkmale und Spezifikationen entscheidend sind. Das erleichtert den Vergleich verschiedener Detektoren und ihre Bewertung im Hinblick auf konkrete chromatographische Trennungen.
Weitere Informationen zu diesem Thema erhalten Sie bei unserer Autorin: huhmann@knauer.net
Literatur
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