Ein Blick auf die Entwicklung von HPLC-Injektionsdesigns

Ein Blick auf die Entwicklung von HPLC-Injektionsdesigns

Der Sommer steht vor der Tür. Höchste Zeit, das Fahrrad wieder fit für die Saison zu machen! Doch die Reifen sind platt, also greifst du zur Luftpumpe. Anfangs geht das Aufpumpen mühelos von der Hand. Doch je näher du dem gewünschten Druck von 4 bar kommst, desto anstrengender wird jeder Pumpenhub. Immer mehr Luft in ein bereits unter Druck stehendes System zu pressen, erfordert ganz schön Kraft.

Eine ähnliche Herausforderung besteht in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), allerdings auf einer völlig anderen Größenordnung. Statt 4 bar können die Drücke 1.000 bar übersteigen, und anstelle von Luft arbeitet man mit flüssigen Lösungsmitteln und oft auch mit gefährlichen Substanzen. Eine Probe in eine solche Umgebung einzubringen, ist alles andere als trivial. Die Entwicklung von einfachen septumbasierten Injektionsverfahren hin zu den ersten Autosamplern erstreckte sich über mehrere Jahrzehnte, und selbst heute geht die Innovation weiter, angetrieben von dem Ziel, die Laufzeiten zu verkürzen und gleichzeitig die Datenqualität zu verbessern.

Die Anfänge

In den 1950er Jahren war die klassische, gravitative Flüssigkeitschromatographie zwar bereits seit fast 50 Jahren etabliert, ihre weitere Entwicklung wurde jedoch durch zwei große technische Hürden eingeschränkt: die Verwendung kleinerer Partikelgrößen und die Notwendigkeit höherer Betriebsdrücke [1]. Diese Herausforderung wurde von Csaba Horváth und seinen Kollegen erfolgreich bewältigt, die um 1965 das erste HPLC-System entwickelten [2]. Seitdem haben zahlreiche technologische Fortschritte die HPLC zu einer äußerst robusten und präzisen analytischen Technik gemacht.

In den Anfangszeiten musste die Injektion manuell durchgeführt werden, entweder in ein bereits unter Druck stehendes System oder durch ein vorübergehendes Unterbrechen des Flusses der mobilen Phase. Die Reproduzierbarkeit und die quantitative Genauigkeit waren dabei alles andere als ideal, was den Bedarf an zuverlässigeren und standardisierten Injektionsmethoden deutlich machte.​

Einführung des rotierenden 6‑Port‑Ventils

Ein großer Fortschritt gelang mit der Erfindung des Mehrport‑Drehprobenventils in den späten 1970er Jahren, das zur Grundlage der modernen HPLC‑Injektion wurde. Insbesondere setzte sich das Sechsportventil mit definierter Probenschleife als Industriestandard durch [3]. Sein Stator verfügt über sechs Anschlüsse: zwei zur Verbindung mit dem System, zwei für Probenaufgabe und Abfall sowie zwei, die speziell der Probenschleife zugeordnet sind. Die eigentliche Funktion entsteht an der Rotor­dichtung, die gegen die Rückseite des Stators gepresst wird, wo präzise gefertigte Kanäle die internen Fließwege bestimmen.

Der Betrieb basiert auf zwei klar getrennten Positionen: LOAD und INJECT (Abbildung 1). In der LOAD-Position wird die Probe manuell mit einer Spritze in die Probenschleife eingebracht, während die mobile Phase ununterbrochen von der Pumpe zur Säule weiterfließt. Beim Umschalten des Ventils in die INJECT-Position wird die gefüllte Probenschleife in den Hochdruck-Flussweg geschaltet, sodass die Probe auf definierte und sichere Weise auf die Säule übertragen wird.​

Heute bietet KNAUER eine breite Palette an manuellen und motorisierten Ventilen an, die von Zwei-Positions- über Mehrpositions- bis hin zu Spezialausführungen reichen. Die Ventile der AZURA V 4.1‑Serie lassen sich nahtlos in moderne chromatographische Systeme integrieren und unterstützen ein breites Spektrum individueller Anwendungen.

Fig. 1: 6-port 2-position valve. Left: LOAD. Right: INJECT. Bottom: KNAUER AZURA AZURA V 4.1 valve. Graphic by KNAUER

Mit der zunehmenden Verbreitung der HPLC für analytische Anwendungen wurden jedoch die Einschränkungen der manuellen Injektion über Ventilanschlüsse immer deutlicher. Proben mussten weiterhin von Hand durch Drehen eines mechanischen Hebels injiziert werden, was den Probendurchsatz in einer Zeit steigender Probenzahlen erheblich begrenzte. Die Qualität hing stark von der Erfahrung des Bedieners ab, da Schwankungen im Zeitpunkt des Ventilumschaltens und inkonsistentes Befüllen der Probenschleife die Reproduzierbarkeit direkt beeinflussten. Eine automatisierte Lösung war erforderlich.

Injektionsdesigns von Autosamplern

Autosampler wurden Mitte der 1980er Jahre entwickelt, wobei Injektionsventile weiterhin die zentrale Komponente darstellen. (Fun Fact: Bereits 1974 stellte KNAUER als erstes Unternehmen in Europa modulare HPLC‑Systeme her.) Es handelt sich um elektrisch betriebene Injektionseinheiten mit einem zusätzlichen Probenlager, das in der Regel Vials oder Mikrotiterplatten aufnehmen kann [4]. Ihre Leistungsfähigkeit lässt sich anhand von (mindestens) vier zentralen Kriterien bewerten:

1. Präzision beschreibt die Wiederholbarkeit des Systems und wird typischerweise anhand der relativen Standardabweichung (RSD) von Peakflächen oder Retentionszeiten aus wiederholten Messungen (üblicherweise n = 5) bewertet.
2. Linearität beschreibt, wie konsistent das Detektorsignal mit zunehmenden Injektionsvolumina ansteigt. Idealerweise sollte eine schrittweise Erhöhung des Injektionsvolumens zu einer proportionalen Zunahme des Signals und zu einem R²‑Wert nahe 1 führen.
3. Carryover entsteht, wenn Analytrückstände an der Außenseite der Nadel, im Injektionsventil oder in der Probenschleife verbleiben und dadurch nachfolgende Messungen kontaminieren. Dieses Problem kann durch das Spülen der Nadel und des Injektionsventils reduziert werden, was jedoch häufig mit längeren Zykluszeiten einhergeht.
4. Cycle time – Zeit ist Geld. Kürzere Laufzeiten ermöglichen die Verarbeitung einer größeren Anzahl von Proben pro Tag und senken somit sowohl den Arbeitsaufwand als auch die Geräteauslastung. Allerdings kann die Minimierung der Laufzeit mit Maßnahmen wie einer intensiven Nadelspülung in Konflikt stehen, die notwendig ist, um Carryover zu reduzieren.

Lassen Sie uns nun in die drei Konstruktionsprinzipien der Autosampler-Injektion eintauchen.

Pushed-Loop-Design: Am engsten mit der manuellen Ventilinjektion verwandt ist das Pushed‑Loop‑Design (Abbildung 2). In der LOAD-Position wird die Probe in eine Aspirationskapillare aufgenommen und vorübergehend außerhalb des Hauptflussweges gespeichert. Anschließend bewegt sich die Injektionsnadel zum Niederdruck‑Nadelport, übt Druck aus und drückt (push) die Probe in die umgangene Probenschleife. Das Ventil schaltet in die INJECT-Position, wodurch die Probenschleife mit dem von der Pumpe kommenden Fluss der mobilen Phase verbunden wird und der Analyten-Transport auf die Säule erfolgt.

Fig. 2: Pushed-loop design. Left: LOAD. Right: Sample introduction (PUSH). Bottom: INJECT. Graphic by KNAUER

Pulled‑Loop‑Design: Der komplementäre Ansatz ist das Pulled‑Loop‑Design (Abbildung 3). In diesem Konzept wird die Aspirationskapillare durch die Probenschleife selbst ersetzt. In der LOAD-Position wird der Analyt angesaugt und direkt in die Probenschleife gezogen (pull). Sobald das Ventil in die INJECT-Position geschaltet wird, wird die Probenschleife unmittelbar in den Flussweg des Systems integriert, während sich die Injektionsspritze zum Waschport bewegt, um nachfolgende Rückstände zu minimieren. Da weder ein Niederdruck‑Nadelport noch zusätzliche Aspirationskapillaren erforderlich sind, reduziert dieses Design potenzielle Leckstellen und senkt die Betriebskosten insgesamt.

Das robuste und kosteneffiziente Pulled‑Loop‑Design kommt im KNAUER AZURA ​AS 6.1L zum Einsatz. Das Gerät ist in verschiedenen Konfigurationen erhältlich, darunter temperaturgeregelte, biokompatible, präparative und UHPLC‑Varianten.

Fig. 3: Pulled-loop design. Left: LOAD. Right: INJECT. Bottom: KNAUER autosampler AZURA AS 6.1L. Graphic by KNAUER

Typischerweise können Anwender zwischen drei Injektionsmodi wählen: Full‑Loop, Partial‑Loop und µl‑Pickup. Die Full‑Loop‑Injektion bietet die höchste Präzision und Wiederholbarkeit, da die Probenschleife vollständig gefüllt wird. Dies geht jedoch mit einem höheren Probenverbrauch einher, da die Kapillare von der Nadelspitze bis zur Probenschleife gespült werden muss und eine Überfüllung der Probenschleife empfohlen wird. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Partial‑Loop‑Injektion eine flexible Anpassung der Injektionsvolumina und eignet sich daher besonders für Anwendungen wie Verdünnungsreihen. Auch bei diesem Injektionsmodus ist eine Kapillarspülung von der Nadelspitze bis zur Probenschleife erforderlich, was ebenfalls Probenvolumen verbraucht. Die µl‑Pickup‑Methode minimiert den Probenverlust, indem nur das exakt benötigte Volumen angesaugt wird, und ist daher die bevorzugte Option, wenn nur begrenzt Probe zur Verfügung steht. Die Spülung der Verrohrung erfolgt hierbei mit einem Transportlösungsmittel, wodurch Probenvolumen eingespart wird..

Es gibt jedoch immer Raum für Verbesserungen, was uns zum modernen Standard führt. Ziel war es, Probenverbrauch, Zykluszeiten und Carryover zu optimieren und gleichzeitig die Präzision zu erhöhen.

Split‑Loop‑Design: Der wesentliche Unterschied liegt hier im Hochdruck‑Nadelsitz, der einen integralen Bestandteil des Systemflusswegs bildet (Abbildung 4). In der LOAD-Position wird der Flussweg unterbrochen (split), und der Analyt wird direkt in die Probennadel angesaugt. Ein anschließender Waschschritt reduziert mögliche Verunreinigungen an der äußeren Nadeloberfläche. Danach wird die Nadel im Sitz positioniert. Auch wenn diese Konfiguration auf den ersten Blick der Pushed‑Loop‑Injektion ähnelt, besteht ein grundlegender Unterschied: Die Probennadel ist nun Teil des Flusswegs, wodurch der Nadelsitz unter vollem Systemdruck arbeitet. Dies erfordert eine präzise abgestimmte Abdichtung zwischen Nadel und Sitz, die in UHPLC‑Anwendungen Betriebsdrücken von bis zu mehr als 1.000 bar standhalten kann. Ist diese Verbindung hergestellt, wird das Ventil in die INJECT-Position geschaltet und die Probe vollständig in den Systemflussweg integriert. Da die Nadel nun Teil des HPLC‑Flusswegs ist, wird sie intensiv mit Eluent gespült. In der Regel sind keine zusätzlichen Waschschritte für die Nadel erforderlich, was die Zykluszeiten reduziert.

Mit dem AS 8.1L stellt KNAUER einen neuen Autosampler vor, der das moderne Split‑Loop‑Design für (U)HPLC‑Anwendungen nutzt.

Fig. 4: Split-loop design. Left: LOAD. Right: INJECT. Bottom: KNAUER autosampler AZURA AS 8.1L. Graphic by KNAUER

Somit vermeidet das Split‑Loop‑Design praktisch Probenverluste, reduziert die Gesamtlaufzeiten, minimiert Carryover und gewährleistet eine hohe Injektionspräzision. Um jedoch einen zuverlässigen Langzeitbetrieb sicherzustellen, sollten die Hochdruck‑Probennadel und der zugehörige Nadelsitz jährlich gewartet werden.

Tab. 1: Kurzvergleich der Systeme KNAUER AS 6.1L (Pulled‑Loop) und AS 8.1L (Split‑Loop).

Features	AS 6.1L Pulled-loop	AS 8.1L Split-loop
Mechanical simplicity/Flexibility	+	0
Maintenance (e.g. needle seat)	+	0
Sample conservation	0	+
Cycle times	0	+
Carryover / Precision	0	+
Dwell volume	+	0

Abschließende Gedanken

Ziel dieses Blogbeitrags war es zu zeigen, dass die Probeninjektion alles andere als trivial ist, und einen kurzen Überblick über die Forschung und Entwicklung hinter den Injektionstechniken zu geben, ein Thema, das mir persönlich viel Freude bereitet hat. In diesem Zusammenhang möchte ich Sie ermutigen, die unten aufgeführten Quellen zu erkunden, die zahlreiche weitere Einblicke bieten. Ich hoffe, ich konnte etwas von dieser Begeisterung vermitteln und Ihnen einen Eindruck von der Entwicklung der Injektionsprinzipien geben.

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Für weitere Informationen zu diesem Thema wenden Sie sich bitte an unseren Autor unter: busse@knauer.net

Referenzen:

[1] L.S. Ettre (2005). Csaba Horváth and the Development of the Frist Modern High Performance Liquid Chromatogrpah. LCGC. Volume 23. Issue 5. https://www.chromatographyonline.com/view/csaba-horv-th-and-development-first-modern-high-performance-liquid-chromatograph

[2] C. Horvath & S. Lipsky (1966). Use of Liquid Ion Exchange Chromatography for the Separation of Organic Compounds. Nature 211, 748–749. https://doi.org/10.1038/211748a0

[3] R. Majors & J. Baltrus (2020). The Analyical Scientist: theanalyticalscientist.com/issues/2020/articles/sep/the-top-10-game-changers-in-hplc-history

[4] F. Steiner, C. Paul & M.W. Dong (2019). HPLC Autosamplers: Perspectives, Principles, and Practices. LCGC. Volume 37, Issue 8 https://www.chromatographyonline.com/view/hplc-autosamplers-perspectives-principles-and-practices