Automatisierte zweistufige Reinigung mit Kationenaustauschchromatographie und Entsalzung

Ulrike Krop, Kate Monks; applications@knauer.net KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Hegauer Weg 38, 14163 Berlin

Zusammenfassung

In vielen Fällen erfordert die Proteinreinigung zwei oder sogar mehr Schritte, um eine ausreichende Reinheit zu erreichen. Der Übergang von einem Schritt zum anderen kann sehr zeitaufwendig sein und erfordert manuelle Interaktion. Diese Einschränkungen verdeutlichen die Notwendigkeit von FPLC-Systemen, die eine automatisierte Zweischritt-Reinigung ermöglichen. Diese Anwendung hebt die Möglichkeit hervor, zwei aufeinanderfolgende Chromatographieprotokolle zu kombinieren. Dies wurde mit dem KNAUER Lab Standard Multi Method FPLC-System erreicht, das für die automatische Zweischritt-Reinigung angepasst wurde. Eine beispielhafte Trennung von Modellproteinen durch Kationenaustauschchromatographie, gefolgt von Entsalzung, wird gezeigt. Dieser Ansatz kann leicht an verschiedene Protokolle zur Proteinreinigung angepasst werden.

Einführung

Für viele Proteinreinigungen werden mehrere chromatographische Schritte verwendet, um reines Protein zu erreichen. Je nach gewünschtem Ertrag und Reinheit des Zielproteins werden verschiedene Methoden kombiniert. In vielen Fällen werden zwei Schritte zur Proteinreinigung verwendet. Für die Zweischritt-Reinigung werden zwei unabhängige Methoden, jeweils mit ihrer spezifischen Säule, eingesetzt, um die Reinigung des Zielmoleküls ohne manuelle Eingriffe zu realisieren. Das allgemeine Prinzip besteht darin, dass die Proteinprobe auf die erste Säule aufgetragen wird. Während der Elution des Proteins wird der Proteinpeak erkannt, was seine Sammlung in einer Speicher-Schleife oder einem Speicherbehälter auslöst. Anschließend wird das Zielprotein automatisch auf die zweite Säule aufgetragen, um die Qualität und/oder Reinheit weiter zu verbessern. Die schnelle und automatisierte Verbindung von zwei chromatographischen Reinigungsstufen zu einer Methode eliminiert die manuelle Probenhandhabung und minimiert die Zeit, die zwischen den Schritten benötigt wird. Diese Automatisierungsstrategie kann leicht an verschiedene Reinigungsaufgaben angepasst werden, um Ihre Effizienz zu steigern und den Arbeitsablauf zu optimieren. In diesem Anwendungsnotiz wurde ein KNAUER Lab Standard Multi Method FPLC-System für alle biochemischen Chromatographiemethoden für die Zweischritt-Reinigung angepasst. Zwei Modellproteine, Cytochrom C und Ribonuklease A, wurden durch Kationenaustauschchromatographie getrennt. Cytochrom C wurde automatisch in einer Proben-Schleife gespeichert und auf eine zweite Säule für den Pufferaustausch mit einer Entsalzungssäule aufgetragen.

Ergebnisse

Der erste Schritt der Trennung war die Kationenaustauschchromatographie. Die Proteine wurden aufgrund ihrer positiven Ladung im Puffer bei pH 6,8 ausgewählt. Ribonuklease A hat einen isoelektrischen Punkt von 9,6, während für Cytochrom C ein Bereich von 10,37 bis 10,80 für den isoelektrischen Punkt angegeben ist. Unter den Anfangsbedingungen bindeten beide Proteine an die Kationenaustauschsäule. Während der Gradientenelution eluierte zuerst Ribonuklease A und später Cytochrom C aus der Säule (Abb. 1). Ein Schwellenwertsignal (Abb. 1, rote Linie) wurde verwendet, um Cytochrom C zu detektieren, was die Zwischenlagerung in der Proben-Schleife auslöste. Das Cytochrom C wurde anschließend erneut auf die Entsalzungssäule injiziert, um den Puffer auf die endgültigen Pufferbedingungen auszutauschen (Abb. 2). Das eluierte Protein wurde fraktioniert.

Abb. 1 Chromatogramm der Kationenaustauschmethode. Blaue Linie: UV 280 nm (blau), Leitfähigkeit (schwarz), Schwellenwert zur Peak-Erkennung (rot). 1 - Ribonuklease A, 2 - Cytochrom C.

Abb. 2 Chromatogramm der Entsalzungsmethode. UV 280 nm (blau), Leitfähigkeit (schwarz). 1 - Cytochrom C, 2 - Salzpeak.

Abb. 3 Fließschema des Laborstandards KNAUER Multi Method FPLC-Systems für alle biochemischen Chromatographiemethoden, die für die zweistufige Reinigung mit der Grundausstattung angepasst sind.

Probenvorbereitungen

Lyophilisiertes Cytochrom C aus dem Rinderherz (CAS# 9007-43-6) und lyophilisierte Ribonuklease A aus der Rinderbauchspeicheldrüse (9001-99-4) wurden verwendet. Beide Proteine wurden in Puffer A auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml gelöst. Insgesamt wurden 2 ml Probe (1 mg jedes Proteins) für jede Reinigung injiziert. Die Probe wurde vor der Verwendung gefiltert (0,45 µm). Ein Labornorm KNAUER Multi Method FPLC-System für alle biochemischen Chromatographiemethoden wurde für die zweistufige Reinigung angepasst. Ein Säulenauswahlventil und ein Auslassventil wurden dem System hinzugefügt. Dies zeigt die grundlegende Einrichtung für die zweistufige Reinigung. Die Reinjektionsposition des Auslassventils war mit dem Probenpumpeneingang des Injektionsventils verbunden. Die Probe wird über die Proben-Schleife des Injektionsventils injiziert. Der erste Peak wird ebenfalls in der Proben-Schleife des Injektionsventils gesammelt und auf die zweite Säule reinjiziert.

Fazit

Das Modellprotein Cytochrom C wurde erfolgreich aus Ribonuklease A durch eine automatisierte Kombination aus Kationenaustauschchromatographie und einer Entsalzungsmethode auf dem Labornorm KNAUER Multi Method FPLC-System im Grundaufbau für die zweistufige Reinigung isoliert. Es war keine manuelle Interaktion erforderlich. Dieses Methodensetup könnte leicht an andere Reinigungsprotokolle zur Trennung und Reinigung von Biomolekülen angepasst werden.

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Materialien und Methoden

Tab. 1 Methode

Tab. 2 Kationenaustauschmethode

Tab. 3 Entsalzung

Waschen und Äquilibrierung der Kationenaustauschmethode

Tab. 5 Systemkonfiguration

Application details