Spalten-Screening für Oligonukleotid-Analyse und Qualitätskontrolle

J. Kramer1, N. Schneider2, K. Folmert1, M. Schäk1; kramer@knauer.net 
1KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Hegauer Weg 38, 14163 Berlin 

2BianoGMP GmbH, Ronneburger Straße 74, 07546 Gera, Germany​

Zusammenfassung

Welche Eigenschaften muss eine Säule haben, um für die Oligonukleotidanalyse geeignet zu sein? Sie muss bestimmten Bedingungen standhalten, wie erhöhten Temperaturen und pH-Werten. Daher ist Stabilität ein entscheidender Punkt für die Aufrechterhaltung von Robustheit und Wiederholbarkeit. Die folgenden Daten zeigen die Ergebnisse eines Säulenscreenings für die Oligonukleotidanalyse.

Einführung

Das Interesse an Oligonukleotiden in verschiedenen Forschungsbereichen, insbesondere in der medizinischen Forschung, ist seit der Corona-Pandemie enorm gestiegen. Eine zuverlässige und hochauflösende Analysemethode ist die Grundlage für jede Anwendung der variantenreichen Oligonukleotidmoleküle. Eine der am häufigsten gewählten Methoden zur Analyse von Oligonukleotiden ist die Ion-Paar-Reversed-Phase (IP-RP) Chromatografie. IP-RP verwendet ein Ion-Paar-Reagenz, um die Ladung des Moleküls zu maskieren, die eine Retention auf einer klassischen RP-Säule verhindern würde. Die Quantifizierung von Oligonukleotiden kann leicht durch UV-Detektion erfolgen, da Oligonukleotide eine starke Absorption bei 260 nm zeigen. Zum Vergleich der gesichteten Säulen wurde die Reinheit eines Oligonukleotids bestimmt. Das Rohprodukt, das Endprodukt und ein gereinigter Strang aus einem DNA-Vollthiolat 43mer wurden verwendet.

In dieser Arbeit haben wir erneut mit der BianoGMP GmbH zusammengearbeitet. Das Unternehmen ist auf die Produktion von hochreinen und qualitativ hochwertigen Oligonukleotiden spezialisiert und verfügt über viele Jahre Erfahrung in der Entwicklung von therapeutischen Oligonukleotiden mit einem Fokus auf GMP-Dienstleistungen und analytische Methoden für Oligonukleotide.

Probenvorbereitung

Die angezeigten Daten wurden von BianoGMP GmbH bereitgestellt.

Ergebnisse

Die Oligonukleotidproben wurden unter IP-RP-Bedingungen gemessen. Die gleiche Methode wurde angewendet, um die Proben auf verschiedenen Säulen zu messen. Abb. 1 und Abb. 2 zeigen den Vergleich der Messung von zwei verschiedenen Rohprodukten nach der Synthese, Spaltung und Deprotection, bevor irgendwelche Reinigungsschritte durchgeführt wurden.

Fig. 1 Überlagerte Chromatogramm des Rohprodukts von 43mer; dunkelblau – KNAUER Sepapure® oliGO-Säule, hellblau - Waters XBridge™ BEH-Oligonukleotidsäule.

Fig. 2 Überlagerte Chromatogramm des Rohprodukts des dT18-Linkers; dunkelblau – KNAUER Sepapure oliGO-Säule, hellblau - Waters XBridge™ BEH-Oligonukleotidsäule.

Die Säulen zeigen ein ähnliches Verhalten. In Bezug auf die Schulter rechts vom Peak zeigte die KNAUER-Säule eine leicht bessere Auflösung. Die Verschiebung der Retentionszeit kann durch die unterschiedlichen chemischen Eigenschaften der stationären Phasen sowie durch geringfügige Unterschiede in der Poren- und Partikelgröße erklärt werden (Abb. 3).

Fig. 3 Überlagerte Chromatogramm des gereinigten dT18-Linkers; dunkelblau – KNAUER Sepapure oliGO-Säule, hellblau – Waters XBridge™-Säule.

Fig. 4 Überlagerte Chromatogramm des Endprodukts von 43mer (DNA Vollthiolat); dunkelblau – KNAUER Sepapure oliGO-Säule, hellblau – Waters XBridge™ BEH Oligonukleotidsäule.

Während aller Messungen zeigten die gescreenten Säulen ein sehr ähnliches Verhalten hinsichtlich Auflösung, Peaksymmetrie und Peakflächen (Abb. 4). Die erreichten Reinheiten waren vergleichbar mit früheren Ergebnissen, die von BianoGMP bestimmt wurden.

Fazit

Die Messungen zeigen nahezu keine Unterschiede zwischen den Säulen. Die KNAUER Sepapure oliGO-Säule ist eine gute Alternative zur häufig verwendeten Konkurrenzsäule für die Oligonukleotidanalyse.

Material und Methoden

Tab. 1 Instrumente

Anwendungsdetails