Systematische und effiziente Methoden-Skalierung zur Peptidreinigung

J. Menke, U. Krop, G. Greco; menke@knauer.net

KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Hegauer Weg 38,

14163 Berlin; www.knauer.net/

Zusammenfassung

Peptide, die für therapeutische Fortschritte entscheidend sind, werden durch verfeinerte Methoden in der Biotechnologie synthetisiert. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) spielt eine entscheidende Rolle, um die Reinheit der synthetisierten Peptide sicherzustellen. Die lineare Skalierung von HPLC-Methoden wird unerlässlich, um die Produktivität und Robustheit der Methode in pharmazeutischen und analytischen Laboren zu steigern. Dieser Prozess umfasst sorgfältige Anpassungen an Parametern wie Säulengröße und Lösungsmittelzusammensetzung, um eine konsistente chromatographische Leistung aufrechtzuerhalten. Die Skalierung beginnt mit der Optimierung der Methode im größeren Maßstab, um minimale Probenverluste bei maximaler Produktivität zu gewährleisten.

Einführung

Peptide, die aus kurzen Ketten von Aminosäuren bestehen, überbrücken die Lücke zwischen kleinen organischen Molekülen und großen Proteinen. Sie bieten Vorteile wie Spezifität, Selektivität und eine geringere Immunogenität. Die jüngsten Zulassungen von peptidbasierten Arzneimitteln unterstreichen ihre wachsende Bedeutung in therapeutischen Bereichen wie Stoffwechselerkrankungen, Herz-Kreislauf-Gesundheit und Onkologie [1].

Die Peptidsynthese umfasst die Bildung von Peptidbindungen zwischen Aminosäuren zur Bildung von Peptiden. Festphasen- und Flüssigphasenmethoden werden häufig eingesetzt, wobei die von Merrifield eingeführte Festphasen-Synthese hervorzuheben ist. Dieser Prozess wurde durch Innovationen in der Automatisierung und Chemie verfeinert [2].

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) dient sowohl analytischen als auch Reinigungszwecken in der Peptidsynthese [3]. Sie wird eingesetzt, um den Reaktionsverlauf zu verfolgen, die Identität von Zwischenprodukten zu überprüfen und die Reinheit des finalen Peptids zu bestätigen [3]. Hier zeigen wir die Entwicklung einer HPLC-Methode und die Skalierung der Methode zur Peptidreinigung. Als Modell haben wir Angiotensin I ausgewählt, einen Vorläufer im Renin-Angiotensin-System, der für die Regulierung des Blutdrucks, die Aufrechterhaltung des Elektrolytgleichgewichts und den Gefäßtonus von entscheidender Bedeutung ist [4].

Die Skalierung von HPLC-Methoden erfordert eine lineare Skalierung, bei der Anpassungen an Parametern wie Flussrate, Säulengröße und Lösungsmittelzusammensetzung proportionale Beziehungen aufrechterhalten. Dies gewährleistet eine konsistente chromatographische Leistung bei erhöhten Probenvolumina, was für pharmazeutische und analytische Labore entscheidend ist, die die Produktivität steigern und gleichzeitig die Robustheit der Methode aufrechterhalten möchten.

Für den Scale-up-Prozess ist eine optimierte analytische HPLC-Methode der erste Schritt. Zunächst wird die Partikelgröße der stationären Phase auf die präparative Skala angepasst. Die Methode wird dann an die neue stationäre Phase unter Berücksichtigung der späteren Reinigung angepasst. Der nächste Schritt, bevor zur präparativen Skala gewechselt wird, besteht darin, eine Volumenüberlastungsstudie durchzuführen. Diese Experimente geben Einblicke in das Elutionsverhalten der Zielsubstanzen und mögliche mitelutende Verunreinigungen. Schließlich wird für die Reinigung ein linearer Scale-up durchgeführt. Alle bewerteten Methodenparameter werden auf die gewünschte Dimension der präparativen Säule skaliert. Da der Scale-up linear ist, ist die Elution vorhersehbar, und die Reinigung kann beginnen, ohne signifikante Mengen an Probe für die Methodenbewertung zu verlieren.

Probenvorbereitung

Die rohe Angiotensin I Probe wurde kommerziell bezogen (ProteoGenix SAS, Schiltigheim, Frankreich) als lyophilisiertes Pulver mit einer nominalen Reinheit von 68,05 %. Die Rohsubstanz wurde in 25:75 Acetonitril (Gradientenqualität)/destilliertem Wasser (v:v) rehydriert. Eine Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurde vorbereitet. Die Lösung wurde mit einem Spritzenfilter mit einer 0,45 µm regenerierten Cellulosemembran (RC) filtriert.

Ergebnisse

Das rohe Peptid wurde mit einem analytischen HPLC-System gemessen (siehe Abb. 1). Eine Methode mit einem Überblicksgradienten von 10 bis 100 % organischem Eluent wurde angewendet. Ein großer Peak wurde als Angiotensin I identifiziert. Mehrere benachbarte Verunreinigungen wurden beobachtet. Die Reinheit des rohen Angiotensin I wurde mit etwa 68,05 % bestätigt (Ziel-Peakfläche im Verhältnis zu den Flächen der Verunreinigungspeaks).

Als erster Schritt zur Skalierung einer analytischen Methode wurde die Partikelgröße von 5 auf 10 µm erhöht (siehe Abb. 2), um den Anstieg des Rückdrucks bei höheren Flussraten im präparativen Maßstab zu verringern. Ein fokussierter Gradient wurde angewendet, um die Auflösung von Angiotensin I und den benachbarten Verunreinigungen zu erhöhen (siehe Abb. 3). Die Methode wurde verkürzt, indem ein Waschschritt mit 100 % organischem Eluent in den Gradient eingeführt wurde, gefolgt von einem Gleichgewichtsschritt zu den Ausgangsbedingungen. Dies entfernte alle spät eluierenden Verunreinigungen und verkürzte die Gesamtlaufzeit der Methode.

Mit einer optimierten Methode wurde eine Volumenüberlastungsstudie durchgeführt, um Einblicke in das Elutionsverhalten der Zielpeaks zu gewinnen (siehe Abb. 4). Es wurde beobachtet, dass bei einem Injektionsvolumen von über 50 µl die Trennung von Verunreinigungen und Zielsubstanz schlecht war. Daher wurde 50 µl als Berechnungsbasis für die Skalierung genommen. Da alle Experimente im analytischen Maßstab durchgeführt wurden, konnte der Probenverlust minimal gehalten werden. Der nächste Schritt im linearen Skalierungsworkflow war die Erhöhung des inneren Durchmessers (ID) der Säule von 4 auf 20 mm. Mit dem KNAUER HPLC Method Converter wurden die Parameter für die präparative Skalierung berechnet (siehe Abb. 5) (https://www.knauer.net/software-hplc-method-converter).

Schließlich wurde das Verfahren auf preparative Maßstäbe und ein preparatives HPLC-System übertragen. 2000 µl der Rohprobe mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurden injiziert. Der Zielpeak eluierte wie vorhergesagt und wurde bereits mit dem ersten Lauf fraktioniert. Fraktionsschnitte von 2,5 ml wurden ausgewählt. Die Zielfraktionen wurden zusammengefasst und mit der ursprünglichen analytischen HPLC-Methode analysiert, was eine Reinheit von > 99 % bestätigte (siehe Abb. 6). Das ergibt 1,4 mg des gereinigten Peptids pro Lauf.

Abb. 7  Methoden-Skalierung mit dem „KNAUER HPLC Method Converter“

HERUNTERLADEN HPLC-METHODENKONVERTER

Abb. 8  Struktur von Angiotensin

Fazit

Zusammenfassend hat sich die lineare Skalierung der analytischen HPLC-Methode zur Reinigung von rohem Angiotensin I als effektiv erwiesen, um die Reinheit des Zielpeptids zu erhöhen. Durch systematische Erhöhung der Partikelgröße und Anpassung der Methodenparameter, wie dem Gradient und dem Injektionsvolumen, wurde die Methode für die präparative Skala optimiert. Der erfolgreiche Transfer zu einem präparativen HPLC-System, geleitet von den Prinzipien der linearen Skalierung, ermöglichte eine effiziente Fraktionierung des Zielpeptids, wobei eine hohe Reinheit (>99%) in den gepoolten Fraktionen erreicht wurde. Dies unterstreicht die Bedeutung der linearen Skalierung für die Aufrechterhaltung der Robustheit der Methode und die Gewährleistung der erfolgreichen Reinigung von Peptiden in größerem Maßstab.

Material und Methoden

Tab. 1 Übersicht Gradient

Tab. 2 Fokussierter Gradient

Tab. 3 Vorbereitende Methode

Tab. 4 AZURA® analytisches HPLC-System

Tab. 5 AZURA® semi-preparatives System

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Referenzen

[1] Vora, D., Dandekar, A. A., Banga, A. K. In Peptidtherapeutika: Grundlagen von Design, Entwicklung und Lieferung, Jois, S. D., Hrsg., Springer International Publishing, Cham, 2022, S. 183–201.

[2] Bodanszky, M. Prinzipien der Peptidsynthese, Springer, Berlin, Heidelberg, 1993.

[3] Mant, C. T., Chen, Y., Yan, Z., Popa, T. V., Kovacs, J. M., Mills, J. B., Tripet, B. P., Hodges, R. S. In Peptidcharakterisierung und Anwendungsprotokolle, Fields, G. B., Hrsg., Humana Press, Totowa, NJ, 2007, S. 3–55.

[4] Reid, I. A. Fortschritte in der Physiologieausbildung 1998, 275, S236-245.

Anwendungsdetails