Großmaßstäbliche Reinigung von Oligonukleotiden mit Ionenaustauschchromatographie

U. Krop¹, T. Pöhlmann², N. Schneider²; krop@knauer.net

¹ KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Hegauer Weg 38, 14163 Berlin
² BianoGMP GmbH, Ronneburger Straße 74, 07546 Gera, Germany

Zusammenfassung

Das Gebiet der Oligonukleotidtherapeutika hat in den letzten Jahren bemerkenswerte Fortschritte gemacht, was zu einem wachsenden Bedarf an gereinigten Oligonukleotiden führt. Eine der klassischen Techniken zur Produktion von Oligonukleotiden ist die chemische Synthese, gefolgt von einem chromatographischen Reinigungsschritt. Besonders für die Skalierung ist die Ionenaustauschchromatographie die ideale Methode aufgrund ihrer hohen Ladefähigkeit in Kombination mit hoher Auflösung und Ausbeute. Hier präsentieren wir die Arbeit von BianoGMP GmbH. Das Unternehmen hat sich auf die Produktion von hochreinen und qualitativ hochwertigen Oligonukleotiden in Mengen von bis zu mehreren Gramm für Forschungs- und Entwicklungs- sowie klinische Programme spezialisiert. BianoGMP GmbH verfügt über viele Jahre Erfahrung in der Entwicklung therapeutischer Oligonukleotide mit einem Fokus auf GMP-Dienstleistungen und Optimierung von Herstellungsprozessen. Hier demonstrieren wir eine erfolgreiche großtechnische Ionenaustauschchromatographie-Reinigung eines Oligo dT mit 95 % Reinheit und 90 % Ausbeute.

Einführung

In den letzten zwei Jahrzehnten sind Oligonukleotide zu einem wichtigen Werkzeug in der Grundlagenforschung und einer potenten Technologie für die Arzneimittelentwicklung geworden. Besonders die stillenden Oligonukleotide, wie siRNA und Antisense-DNA, sind in die klinische Entwicklung eingetreten, und die ersten Oligonukleotid-Arzneimittel wurden in den letzten Jahren von der FDA genehmigt (z. B. Patisiran)[1]. Diese auf Oligonukleotiden basierenden Arzneimittel haben ihre therapeutische Wirksamkeit bewiesen und ein ausgezeichnetes Toxikologieprofil gezeigt. Eine große Herausforderung bei der Arzneimittelentwicklung ist die Produktion von GMP-Material, die Skalierung und die Prozessentwicklung. Ein Aspekt im Herstellungsprozess ist die Reinigung des aktiven pharmazeutischen Wirkstoffs (API) und seine Trennung von unerwünschten Nebenprodukten.

Die Chromatographie ist eine weit verbreitete Trenntechnik für (Bio)Moleküle in der Pharmaindustrie, die selektiv, vielseitig und leicht skalierbar ist. Die beiden effizientesten HPLC-Reinigungsmethoden sind die Ion-Paar-Reversed-Phase (IP-RP) Chromatographie oder die Ionenaustauschchromatographie (IEX). IP-RP verwendet ein Ion-Paar-Reagenz, um die Ladung des Moleküls zu maskieren, die eine Retention auf einer klassischen RP-Säule verhindern würde. Allerdings ist die geringe Ladefähigkeit eines der Nachteile dieser Technik und macht sie ungünstig für die Hochskalierung[2]. IEX wird häufig verwendet, da es eine effiziente Methode hinsichtlich Lade- und Trennkapazität ist. Darüber hinaus kann IEX hochskaliert und von der Methodenentwicklung auf präparative sowie kommerzielle Produktionsanlagen übertragen werden. IEX verwendet hauptsächlich wässrige Puffer unter denaturierenden Bedingungen für DNA und nicht-denaturierenden Bedingungen für RNA, Lösungsmittel, die im Vergleich zu den in IP-RP verwendeten Lösungsmitteln umweltfreundlicher sind. Die Stabilität des Materials ermöglicht schnelle und hochdurchsatzfähige Trennungen sowie eine einfache Handhabung des Harzes für die Regeneration und das Nachfüllen der Säule. Einer der größten Vorteile ist die hohe Ladefähigkeit, die eine hohe Auflösung und einen hohen Ertrag bewahrt. Hier beschreiben wir die großtechnische Reinigung von Oligo(dT) mit IEX. Oligo(dT) bindet an den polyA-Schwanz von mRNA und ist ein vielseitiges Werkzeug, das häufig zur Isolierung von mRNA oder als Primer für die cDNA-Synthese verwendet wird.

Experimentell: Probenvorbereitung und Ergebnisse

Das Oligonukleotid wurde synthetisiert und die Daten wurden von der Firma BianoGMP GmbH bereitgestellt. Nach der Festphasen-Synthese wird das Oligonukleotid von der Trägersubstanz abgespalten und durch Inkubation mit Ammoniak von verbleibenden Schutzgruppen deprotektiert. Um die Stabilität und Löslichkeit der Probe zu erhöhen, wird das Oligonukleotid anschließend mit Essigsäure neutralisiert und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von unter 30 mS/cm verdünnt. Darüber hinaus wurde die Konzentration durch photometrische Messung bestimmt. Die HPLC-Analyse bestätigte (Abb. 1) eine Reinheit von 89,1 % der Probe vor der chromatographischen Reinigung. Die Zielreinheit für das Oligonukleotid betrug 95 %.

Abb. 1  Analytisches Chromatogramm des synthetisierten Oligo(dT) vor der IEX-Reinigung

Das rohe Oligonukleotid wird weiter durch preparative HPLC gereinigt. Das benutzerfreundliche AZURA® Prep System wurde für die Reinigung verwendet. Das System war mit einer ternären preparativen Pumpe ausgestattet, die Durchflussraten von bis zu 220 ml/min und eine präzise Gradientenerstellung ermöglichte. Die Reinigung wurde von einem einzelnen UV-Detektor überwacht, der auch zur Auslösung der Fraktionierung über das Fraktionsventil verwendet werden kann. Da das Probenvolumen für diese Trennungen sehr groß ist, wurde die Probe über den dritten Kanal der Gradientpumpe aufgetragen. Ionenaustauschharze sind bekannt für sehr hohe Ladefähigkeiten, während sie eine hohe Auflösung und einen hohen Ertrag beibehalten. Aus diesem Grund wurde ein starker Anionenaustauscher für die Reinigung gewählt. Die Auswahl der Pufferparameter hängt von der Oligospezifikation wie Länge und Modifikationen ab. Ein nicht denaturierender Phosphatpuffer und Natriumbromid als Gegenion wurden für die Reinigung des Oligonukleotids verwendet. Abb. 2 zeigt das Chromatogramm während der Gradientelution. Um den Durchsatz zu erhöhen, wird eine hohe Beladung durchgeführt, was zu einem gesättigten UV-Signal führt. Der Elutionspeak wurde manuell fraktioniert, und die Fraktionen wurden auf die Reinheit des Oligonukleotids analysiert. Die Hinzufügung eines Fraktionssammlers oder Fraktionsventils zur Automatisierung der Sammlung gereinigter Proben ist möglich. Das Pooling der Fraktionen ergab eine Reinheit von 95 % und einen Ertrag von 90 %, wie durch analytische HPLC gezeigt (Abb. 3).

Abb. 2  Chromatogramm der Oligonukleotidreinigung aus 1 l Probe

Abb. 3  Analytisches Chromatogramm von gereinigtem und gepooltem oligo(dT) nach IEX

Tab. 1 Spitzentabelle der analysierten gepoolten Probe

Fazit

Oligonukleotid-basierte Medikamente haben ein hohes therapeutisches Potenzial, aber ihre Produktion kann herausfordernd sein. Es besteht Bedarf an der Entwicklung und Hochskalierung chromatographischer Prozesse. Die Ionenaustauschchromatographie ist eine leistungsstarke Methode für den Reinigungsprozess von Oligonukleotiden aufgrund ihrer hohen Trennleistung, einfachen Handhabung, Prozessstabilität und Skalierbarkeit. Wir haben eine erfolgreiche großtechnische Ionenaustauschchromatographie-Reinigung eines Oligo(dT) mit 95 % Reinheit und 90 % Ausbeute gezeigt.

Abb. 4  Verwendetes AZURA preparatives HPLC-System

Material und Methoden

Tab. 2 Systemkonfiguration

Tab. 3 Präparative Säulenparameter

Tab. 4 Analytische Säulenparameter

Tab. 5 Parameter für die präparative Methode

Referenzen

[1] Wood, H. FDA genehmigt Patisiran zur Behandlung der hereditären Transthyretin-Amyloidose. Nat Rev Neurol 14, 570 (2018).

https://doi.org/10.1038/s41582-018-0065-0

[2] Minkner, R., Boonyakida, J., Park, E. Y., & Wätzig, H. (2022). Oligonukleotid-Trenntechniken zur Reinigung und Analyse: Was können wir für die heutigen Aufgaben lernen?. Elektrophorese, 43(23-24), 2402–2427.

https://doi.org/10.1002/elps.202200079

Anwendungsdetails