Kleinmaßstäbliche SEC mit AZURA® kompaktem FPLC

Ulrike Krop, Kate Monks; applications@knauer.net

KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Hegauer Weg 38, 14163 Berlin

Zusammenfassung

Die Größenausschlusschromatographie (SEC) trennt Moleküle je nach Unterschieden in ihrer Größe. SEC wird häufig als Polierschritt während der Proteinreinigung verwendet und kann auch zur Analyse der Protein-Homogenität eingesetzt werden. In den letzten Jahren hat die Verwendung von SEC im Kleinmaßstab zur Analyse von geringen Probenvolumina oder zur Reinigung kleiner Probenmengen an Bedeutung gewonnen; insbesondere aufgrund der Entwicklung geeigneter Säulen. Hier haben wir eine Machbarkeitsstudie durchgeführt, um die Leistung des AZURA® kompakten SEC-Systems für die Anwendung von SEC im Kleinmaßstab zu bewerten und die Systemkonfiguration für diese Anwendung zu beschreiben.

Einführung

Die Größenausschlusschromatographie ist eine gut etablierte Flüssigkeitschromatographietechnik, die eine poröse Matrix verwendet, um Moleküle basierend auf Größenunterschieden zu trennen. Das grundlegende Trennprinzip der SEC beruht auf der Tatsache, dass kleinere Moleküle eher in die Poren der Säule eintreten, was bedeutet, dass ihre Zeit, die sie in der Säulenmatrix verbringen, länger ist als die von größeren Molekülen. Die Trennungen werden durch die Auswahl optimaler Partikel- und Porengrößen sowie die Länge der verwendeten Säule erleichtert. SEC wird häufig als letzter oder verfeinernder Schritt während der Proteinreinigung eingesetzt, bei dem Proteinproben auf Monodispersität überprüft werden. Inhomogene Proben oder teilweise aggregierte Proben können ein Hinweis auf unsachgemäße Faltung und beeinträchtigte Aktivität sein. Darüber hinaus kann der Oligomerisierungszustand der Probe, der biologisch von Bedeutung sein kann, mithilfe von SEC analysiert werden [1, 2]. Kleinmaßstäbliche SEC-Säulen sind jetzt verfügbar, die eine hochauflösende Analyse oder Kleinmaßstäbliche Reinigung von monoklonalen Antikörpern (mAb) und anderen Biomolekülen ermöglichen. Diese Säulen können höheren Druck standhalten, was es ermöglicht, sie bei höheren Durchflussraten zu verwenden, was zu einer kürzeren Laufzeit führt, während kleine Partikel und Poren eine ausgezeichnete Auflösung bieten. Hier beschreiben wir die Verwendung eines kompakten SEC-Systems, das mit kleinmaßstäblichen SEC-Säulen verwendet werden kann.

Ergebnisse

Das kompakte AZURA Bio SEC-System wurde speziell für zeitintensive SEC-Methoden entwickelt. Für diese Anwendung wurden die Kapillaren des Systems an die Anforderungen der Kleinmengen-SEC angepasst. Um eine mögliche Verdünnung der injizierten Probe zu verhindern, während sie vom Injektionsventil zur Säule wandert, und um eine Peak-Breiterung am Säulenausgang zu vermeiden, wurden die PEEK-Kapillaren durch 0,13 mm ID-Schläuche ersetzt (siehe Abb. 1). Bitte beachten Sie, dass, wenn Fraktionen gesammelt werden, auch der Schlauch, der mit dem Fraktionssammler verbunden ist, geändert werden sollte.

Abb. 1 Systemkonfiguration mit 1/16" PEEK-Kapillaranbindungen vom Drucksensor/Pumpenausgang zum UV-Detektoreingang, rohr 0,25 mm ID, blaues Rohr 0,13 mm ID

Je kleiner der Innendurchmesser des verwendeten Schlauchs ist, desto höher ist der Rückdruck im System. Es sollte Vorsicht walten, da dieser Rückdruck die Druckgrenze Ihrer Säulenhardware oder Ihres Systems überschreiten könnte. Daher haben wir, bevor wir weiter fortfuhren, den Rückdruck im System ohne die Säule analysiert (siehe Abb. 2). Zwei Setups wurden getestet, eines ohne Fraktionensammler (Abb. 2 blaue Linie) und eines mit einem zusätzlichen 70 cm 0,13 mm ID Kapillare zum Fraktionensammler (Abb. 2 rote Linie). Die verwendete Säule (Superdex 200 Increase 3.2/300) wurde bei typischen Durchflussraten von etwa 0,07 ml/min mit einer maximalen Durchflussrate von 0,15 ml/min bei Raumtemperatur betrieben. Die maximale Druckgrenze der Säulenhardware und des Systems beträgt 50 bar. Der typische Druckabfall über das gepackte Bett bei einer maximalen Durchflussrate von 0,15 ml/min bei Raumtemperatur beträgt 20 bar. Beide Setups können mit der Superdex 200 Increase 3.2/300 verwendet werden.

Abb. 2 Systemdruck versus Durchflussrate des AZURA-Kompaktsystems (blau) Druck mit kapillaren Verbindungen wie in Abbildung 1 beschrieben; rot mit zusätzlichem 0,13 mm ID Schlauch zum Fraktionensammler

Im Anschluss daran wurde ein Gelfiltrationsstandard getestet, um die Fähigkeit des Systems für die Kleinmaßstab-SEC zu bewerten. Das Chromatogramm zeigt eine ausgezeichnete Trennung der Standards (Abb. 3). Die Durchflussrate wurde mit einem Durchflussmesser bestätigt. Der gemessene durchschnittliche systemische Druck mit einer Säule betrug 11,7 bar ohne Fraktionensammler und 13,2 bar mit Fraktionensammler. Die Druckschwankung lag unter 1 bar (Daten nicht gezeigt).

Abb. 3 Chromatogramm des Gel-Filtrationsstandards; (1) Thyreoglobulin; (2) Gamma-Globulin; (3) Ovalbumin; (4) Myoglobin; (5) Vitamin B12

Fazit

Das AZURA kompakte SEC-System kann einfach mit kleineren Kapillaren modifiziert werden, um das systemische Totvolumen auf ein Minimum für Anwendungen im kleinen Maßstab zu optimieren. Mit diesen Änderungen war die Durchflussrate für die getestete Anwendung präzise, der Rückdruck lag unter dem systemischen Drucklimit und die Druckschwankungen waren gering. Das Chromatogramm eines SEC-Standards zeigte eine zufriedenstellende Trennung. Wir können die Verwendung des AZURA kompakten SEC-Systems für SEC-Anwendungen im kleinen Maßstab empfehlen.

Materialien und Methoden

Systemkonfiguration

Die Durchflussrate wurde mit einem Mini CORI-Flow (M13) Durchflussmesser gemessen (A5394).

Analytika des Gel-Filtrationskits

*Das Multi-Injektionsventil hat ein internes Portvolumen von 10 µl, was zu einem Gesamtinjektionsvolumen von 20 µl führt (10 µl Ports + 10 µl Probenloop)

Referenzen

[1] Wingfield PT. Übersicht über die Reinigung rekombinanter Proteine. Curr Protoc Protein Sci. 2015;80:6.1.1-6.1.35. Veröffentlicht am 1. April 2015. doi:10.1002/0471140864.ps0601s80

[2] Structural Genomics Consortium., Architektur und Funktion von Biomolekülen., Berkeley Structural Genomics Center. et al. Proteinproduktion und -reinigung. Nat Methods 5, 135–146 (2008). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.202

Anwendungsdetails